Интеграция оптоэлектронных технологий в конфокальную микроскопию значительно повысила универсальность спектрального контроля для широкого спектра флуоресцентных исследований. Акустооптический перестраиваемый фильтр (АОПФ) — это электрооптическое устройство, которое функционирует как электронно-перестраиваемый фильтр возбуждения для одновременной модуляции интенсивности и длины волны нескольких лазерных линий из одного или нескольких источников.
Устройства такого типа основаны на использовании специализированного двулучепреломляющего кристалла, оптические свойства которого изменяются при взаимодействии с акустической волной. Изменения акустической частоты меняют дифракционные свойства кристалла, обеспечивая очень быструю настройку длины волны, ограниченную только временем прохождения акустической волны через кристалл.
Основные принципы работы АОПФ
АОПФ, разработанный для микроскопии, обычно состоит из анизотропного кристалла (например, диоксида теллура или кварца), к которому прикреплен пьезоэлектрический преобразователь. В ответ на подачу осциллирующего электрического сигнала радиочастотного (РЧ) диапазона преобразователь генерирует высокочастотную вибрационную (акустическую) волну, которая распространяется в кристалле.
Чередующаяся ультразвуковая акустическая волна вызывает периодическое перераспределение показателя преломления по всему кристаллу, которое действует как пропускающая дифракционная решетка или дифрактор Брэгга, отклоняя часть падающего лазерного света в пучок первого порядка, который используется в микроскопе. Изменение частоты сигнала преобразователя, подаваемого на кристалл, изменяет период изменения показателя преломления и, следовательно, длину волны дифрагированного света. Относительная интенсивность дифрагированного пучка определяется амплитудой (мощностью) сигнала, приложенного к кристаллу.
Основной механизм акустооптического взаимодействия известен как упругооптический эффект (elasto-optic effect). АОПФ функционирует скорее как полосовой фильтр, чем как дифракционная решетка, поскольку дифракция происходит по всему объему кристалла и затрагивает только ограниченную полосу спектральных частот, которые удовлетворяют условию согласования фаз (или согласования импульсов).
Дифрагированная длина волны (λ) изменяется как функция радиочастотного сигнала f, приложенного к кристаллу. Для определенного набора проектных параметров АОПФ центральная длина волны (λcenter) полосы пропускания определяется следующим уравнением:
λcenter=fV⋅Δn/f
Где V — скорость акустической волны, Δn — двулучепреломление акустооптического кристалла, а f — частота акустической волны.
Коллинеарная и неколлинеарная геометрии АОПФ
Изначальная конструкция АОПФ была коллинеарной , где акустическая и оптическая волны распространяются вдоль одной и той же оси кристалла. Однако коллинеарная геометрия ограничивает использование узким классом кристаллов, который не включает некоторые из наиболее эффективных акустооптических материалов (например, диоксид теллура).
Для использования преимуществ таких материалов была разработана неколлинеарная конфигурация. В этой конструкции:
- Узкополосный дифрагированный свет и падающий широкополосный свет физически разделяются.
- Поскольку они выходят из кристалла по разным траекториям, поляризаторы не требуются.
- Недифрагированный пучок нулевого порядка блокируется светоотсекателем, а отфильтрованный дифрагированный пучок первого порядка используется для освещения образца.
Угол отклонения, возникающий между дифрагированным и недифрагированным пучками после выхода из кристалла, имеет следующее соотношение с двулучепреломлением (Δn) материала кристалла:
θi−θd=Δnsin2θi
Где θi и θd — углы падающего и дифрагированного пучков относительно оптической оси.
Изотропная и анизотропная дифракция
- Изотропная фильтрация имеет критическое ограничение: спектральная полоса пропускания меняется в зависимости от угловой апертуры падающего света, что требует хорошо коллимированного пучка.
- Анизотропный АОПФ имеет преимущество, поскольку узкая полоса пропускания может поддерживаться в широком диапазоне углов падающего пучка. Это достигается за счет некритического согласования фаз, при котором рассогласование импульса, вызванное угловым изменением падающего света, компенсируется угловым изменением из-за двулучепреломления, что позволяет добиться высокого углового поля зрения.
Материалы и характеристики АОПФ
Предпочтительным материалом для АОПФ является диоксид теллура (TeO2) благодаря его высокому акустооптическому показателю качества. Этот показатель отражает такие параметры, как показатель преломления, плотность, скорость акустической волны, полоса пропускания и разрешение.
Преимущества АОПФ в конфокальной микроскопии
Внедрение АОПФ в конфокальные системы устраняет большинство недостатков традиционных интерференционных фильтров (фиксированная длина волны, медленная механическая смена, вибрации) и обеспечивает ряд уникальных преимуществ:
- Высокая скорость и отсутствие вибраций: Обеспечивает быструю одновременную электронную настройку, устраняя механические вибрации и задержки, связанные с колесами фильтров (время смены которых обычно составляет 0,1 - 0,5 секунды).
- Попиксельный контроль: Главное преимущество — способность контролировать интенсивность и/или длину волны освещения попиксельно (pixel-by-pixel), сохраняя при этом высокую скорость сканирования.
- Гибкость в исследованиях: Позволяет освещать выбранные области интереса (ROI) с различной интенсивностью и на разных длинах волн для точного контроля в:
- методах фотообесцвечивания (в том числе минимизируя ненужное обесцвечивание в других областях).
- рациометрической визуализации.
- резонансного переноса энергии.
- спектроскопических измерениях.
- Сдвиг изображения: Зависимость угла отклонения от длины волны может вызвать сдвиги изображения во время настройки, что является недостатком. Однако, если зависимость известна, ошибки могут быть скорректированы с помощью цифровой обработки.